Publications

2004

• Velocimetric third-harmonic generation microscopy: micrometer-scale quantification of morphogenetic movements in unstained embryos
  
  • Débarre Delphine
  • Supatto Willy
  • Farge Emmanuel
  • Moulia Bruno B.
  • Schanne-Klein Marie-Claire
  • Beaurepaire Emmanuel
  Optics Letters, Optical Society of America - OSA Publishing, 2004, 29, pp.2881-2883. We demonstrate the association of third-harmonic generation (THG) microscopy and particle image velocimetry (PIV) analysis as a novel functional imaging technique for automated micrometer-scale characterization of morphogenetic movements in developing embryos. Using a combined two-photon-excited fluorescence and THG microscope, we characterize the optical properties of Drosophila embryos and show that sustained THG imaging does not perturb sensitive developmental dynamics. Velocimetric THG imaging provides a quantitative description of the dynamics of internal structures in unstained wild-type and mutant embryos. (10.1364/OL.29.002881)
  DOI : 10.1364/OL.29.002881
• New biological labels based on functionalized YVO4:Eu nanoparticles
  
  • Giaume Domitile
  • Buissette V.
  • Lahlil K.
  • Gacoin Thierry
  • Boilot Jean-Pierre
  • Casanova Didier
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Sauviat Martin-Pierre
  • Mercuri A.
  • Alexandrou Antigoni
  , 2005, 845, pp.AA6.2. Lanthanide-ion doped oxide (YVO4:Eu) nanoparticles were synthesized as aqueous colloids and functionalized by a bioactive silane shell to be used as fluorescent biological labels. Nanoparticles functionalized with guanidinium groups were able to act as artificial toxins which specifically target Na+ channels. They were individually detectable in live cardiac myocytes. Functionalized oxide nanoparticles appear as a new interesting tool, especially attractive for long-term single-molecule tracking due to their photo-stability and long luminescence lifetime. © 2005 Materials Research Society. (10.1557/PROC-845-AA6.2)
  DOI : 10.1557/PROC-845-AA6.2
• Purification et caractérisation spectroscopique de cytochrome c oxydases.
  
  • Pilet Eric
  , 2004. Les cytochromes c oxydases (CcO), situées dans les chaînes respiratoires eucaryotes et des bactéries aérobiques, catalysent la réduction de l'oxygène en eau, une réaction qui utilise quatre électrons et quatre protons. Ces complexes protéiques membranaires participent également à la formation de la force protonmotrice nécessaire à la synthèse d'ATP, en pompant quatre protons supplémentaires par molécule de dioxygène réduit. Le site actif des CcO aa3 contient un hème de type a de haut spin, l'hème a3, et un atome de cuivre, le CuB. Ces deux cofacteurs peuvent fixer, outre l'O2, d'autres ligands diatomiques impliqués dans la signalisation telle que le monoxyde d'azote (NO) et le monoxyde de carbone (CO). Les travaux présentés dans ce manuscrit, effectué sur l'oxydase mitochondriale et sur des oxydases bactériennes, aa3 et ba3, concernent à la fois l'interaction de ligands avec la CcO et le transfert interne d'électrons. Les oxydases étudiées possèdent quatre centres redox, l'hème a3 et le CuB ainsi que l'hème a (resp. b pour ba3) et le centre CuA, impliqués dans le transfert d'électron (ET) du donneur, le cytochrome c, à l'accepteur, l'oxygène fixé au site actif. L'inhibition réversible de la CcO par le NO est un processus de régulation de la respiration. En étudiant l'influence de la concentration de NO sur la dynamique du NO au sein des oxydases aa3 de P. denitrificans et ba3 de T. thermophilus nous avons mis en évidence une interaction entre plusieurs ligands dans le site actif. Pour l'oxydase aa3, la recombinaison géminée du NO, après sa photodissociation de l'hème a3, a lieu selon deux phases de 200 ps et 20 ns, dont l'intensité augmente pour les concentrations de NO superstoechiométriques. A l'inverse, aucun effet de la concentration n'est observé pour l'oxydase ba3 où l'activité NO réductase de cette CcO exclut la présence stable de deux molécules de NO dans le site actif. L'ensemble de ces résultats converge vers la présence d'une seconde molécule de NO dans ou à proximité du site actif dans l'oxydase aa3, créant un encombrement favorisant une recombinaison géminée plutôt qu'un cheminement vers l'extérieur de la protéine. Des expériences de spectroscopie RPE ont été effectuées afin de déterminer la nature du second site de fixation du NO. La modification du signal avec la concentration de NO est observée uniquement pour l'oxydase aa3. Si le spectre à basses concentrations (NO: CcO<1:1), très similaire à celui obtenu avec l'oxydase ba3, est caractéristique de la liaison du NO sur un hème ayant pour 5ème ligand une histidine, le spectre enregistré à hautes concentrations est similaire à celui mesuré lorsque NO est lié à un hème sans autre ligand en trans. Comme le spectre visible de l'oxydase n'indique pas une rupture de la liaison Fe-NεHis, nous proposons que la 2nd molécule de NO induise une rotation du NO lié à l'hème depuis une position parallèle au plan de l'histidine à une position perpendiculaire à ce plan, rompant ainsi les interactions paramagnétiques entre l'histidine et le NO. Cette interprétation est renforcée par des modélisations de la structure de l'oxydase aa3 avec un et deux molécules de NO dans le site actif. Elles montrent qu'en effet la présence d'un second NO, lié au CuB dans le site actif, induit une rotation du NO lié à l'hème de ~70°. Par ailleurs, à hautes concentrations de NO, il y a apparition d'un signal caractéristique d'une interaction métal de transition-NO, qui peut être attribué, par élimination, à la liaison CuB-NO. L'établissement de la présence simultanée de deux molécules de NO dans le site actif de la CcO aa3 de P. denitrificans dès les faibles concentrations de NO, ouvrent de nouvelles voies dans la compréhension des mécanismes d'inhibition de l'oxydase par le NO. Afin d'étudier plus en détail l'influence de l'environnement du site actif sur la dynamique du NO dans le site actif, le résidu V279 à été substitué par mutagenèse dirigée. Les premiers résultats sur des souches exprimant les oxydases mutées indiquent des modifications de leur activité O2 réductase. Par ailleurs, nous nous sommes intéressé à la vitesse de réduction du site actif par l'hème a. Cette réaction étant trop rapide pour être visualisée par injection d'électrons, nous avons étudié le flux des électrons en sens inverse. Ces expériences ont été effectuées sur l'oxydase mitochondriale dont l'hème a était oxydé et l'hème a3 réduit et lié une molécule de CO. Après photodissociation du CO de l'hème a3, les électrons se répartissent entre les deux hèmes de potentiel redox proche. Par spectroscopie, nous avons ainsi mesuré que 13 ±3 % de ce transfert s'effectue en 1,2 ns; ce temps correspond au transfert intrinsèque. Des études précédentes avaient montré une phase de 3 µs, considérée jusqu'ici comme la phase la plus rapide du ET entre les hèmes. Au regard de nos résultats, cette phase de ET peut être expliquée par le départ du CO du CuB, ce qui modifierait le potentiel redox de l'hème a3. Le transfert intrinsèque des électrons en 1,2 ns, permettrait à l'oxydase, dans des conditions physiologiques ([O2] faibles et e-peu disponibles) de capturer et de réduire l'oxygène en diminuant la durées des périodes où le site actif n'est pas réduit.
• Kinematic analysis of morphogenetic movements involved in mechanically induced gene expression during Dosophila early development
  
  • Supatto W.
  • Brouzès E.
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Moulia Bruno B.
  • Farge Emmanuel
  , 2004, 112 (Suppl.), pp.77-77.
• Second-harmonic microscopy of unstained living cardiac myocytes: measurements of sarcomere length with 20-nm accuracy.
  
  • Boulesteix Thierry
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Sauviat Martin-Pierre
  • Schanne-Klein Marie-Claire
  Optics Letters, Optical Society of America - OSA Publishing, 2004, 29 (17), pp.2031-3. We extend second-harmonic generation (SHG) microscopy to the measurement of sarcomere length in unstained living cardiac myocytes with 20-nm accuracy. We quantify individual sarcomere shortening in the presence of saxitoxin and find that it is in agreement with mechanical measurements of atrial tissue contracture. This functional application of SHG microscopy is generally applicable to quantify the physiological effects of drugs on contractile tissue. Our data also suggest that packed myosin heads in sarcomere thick filaments are responsible for the large second-harmonic endogenous signal in muscle tissue. (10.1364/OL.29.002031)
  DOI : 10.1364/OL.29.002031
• Heme a3-NO interactions in reduced cytochrome c oxidases: binding and recombination dynamics
  
  • Vos Marten H.
  • Pilet Eric
  • Nitschke W.
  • Rappaport F.
  • Soulimane T.
  • Lambry Jean-Christophe
  • Liebl Ursula
  , 2004, 1658 (1-2, EBEC Short Reports Volume 13), pp.159. Cytochrome c oxidase (CcO) has a high affinity for nitric oxide (NO), a property in the regulation of respiration [1]. We have previously shown that recombination kinetics of reduced CcO -NO from P. denitrificans on the picosecond time scale depend strongly on the NO:enzyme stoichiometry and inferred that more than one NO can be accomodated by the active site [2], already at mildly suprastoichimetric NO concentrations. We have now largely extended these studies by studying rebinding dynamics from the picosecond up to the microsecond time scale, by performing parallel steady-state EPR characterizations under similar conditions as the optical experiments, and comparing them with molecular modeling results. A comparative study was performed on CcO ba3 from T. thermophilus, where two NO molecules cannot be copresent in the active site in steady state due to its NO reductase activity [3]. The kinetic results allow to discriminate between different models of NOdependent recombination and show that the overall NO-escape probability out of the protein is high when only one NO is bound to aa3, whereas strong rebinding on the 15-ns time scale was observed for ba3. The EPR characterizations show similar results for aa3 at substoichiometries NO:enzyme ratios and for ba3, indicating formation of a six-coordinate heme-NO complex. The presence of a second NO molecule in the aa3 active site strongly modifies the heme-NO EPR spectrum, and can be rationilized by a rotation of the NO with respect to the proximal histidine. This proposal is consistent with molecular modeling studies. The binding properties of the second NO molecule will also be discussed.
• Interaction of cytochrome c with NO studied by time-resolved raman and absorption spectroscopy
  
  • Cianetti S.
  • Kruglik Sergei
  • Vos Marten H.
  • Turpin P. Y.
  • Martin Jean-Louis
  • Négrerie Michel
  , 2004, 1658 (1-2, EBEC Short Reports Volume 13), pp.218. Recently, it has been shown that cytochrome c (cyt c) released during apoptosis is nitrosylated in mitochondria, the first case of its nitrosylation in vivo (Schonhoff, C. M., Gaston, B., and Mannick, J. B. (2003) J. Biol. Chem., 278, 18265). In native cyt c, the heme-iron is ligated to the protein through two axial bonds, involving histidine and methionine. The nitrosylation of cyt c during apoptosis led to the hypothesis of its activation due to nitric oxide (NO) binding which would induce a structural change of cyt c. Similarly to guanylate cyclase this conformational change may be triggered by the breaking of Fe2 +-methionine bond. For NO binding to occur, the cleavage of the Fe-methionine bond must transiently occur. Consequently, an equilibrium between the following forms should exist with a low dissociation energy of this bond: [Met - Fe - His] <- ->[Met Fe- His] - NO -> [Met NO - Fe - His] This hypothesis is strengthened by the observation that the Fe -Met bond is cleaved already upon a small temperature increase. To investigate the properties of the transient species involved in this scheme, we used flash photolysis and ultrafast detection techniques to generate and characterize the relevant 5-coordinate species. We characterized the ferric and ferrous cyt c NO adducts by steady state Raman spectroscopy and we used ultrafast time-resolved absorption and Raman spectroscopy. TRRR allows to measure the evolution of vibrational frequencies related to structural changes with a time resolution of 0.6 10 12 s. After photoexcitation of nitrosylated ferrous cyt c we observed two relaxation times (t 1 = 2 ps and t 2 = 8 ps) attributed respectively to the vibrational relaxation of the five-coordinate hot species and to the recombination of the NO ligand. These times are of the same order of magnitude as we observe for recombination of methionine ligand in native ferrous cyt c with different relaxation times (t1 = 1.8 ps and t2 = 5.5 ps). The time dependence of Raman spectra of ferrous cyt c and ferrous cyt c NO adducts compared with the stationary spectra show clearly that a conformational change is induced during the ligand release in the case of nitrosylated ferrous cyt c with respect to what observed for native ferrous cyt c. Correlation between this conformational change and the biological activity of the protein will be discussed.
• Ultrafast spectroscopy of electron transfer between hemes in bovine heart cytochrome c oxidase
  
  • Pilet Eric
  • Jasaitis Audrius
  • Liebl Ursula
  • Vos Marten H.
  , 2004, 1658 (1-2, supplement), pp.153. In cytochrome c oxidase, reduction of molecular oxygen in the active site requires transfer of electrons from cytochrome c towards heme a3. This occurs via a chain of redox intermediates. The dynamics of the final step in this chain, reduction of heme a3 by the chemically identical heme a, cannot be resolved in direct external electron injection experiments. Instead electron redistribution can be monitored upon photodissociation of CO from the mixed-valence (MV) enzyme-CO complex. The published value for the equilibration time in the mitochondrial enzyme is f3 As [1]. However, a detailed spectral analysis of the microsecond data (by Wikstro¨m's group) predicted a substantial additional equilibration phase on a much faster time scale [2]. This prediction was contested (by Brzezinski's group) on the basis of nanosecond experiments [3]. We have performed transient absorption experiments with femtosecond resolution and a time window up to 4 ns under selective excitation of heme a3 in the alpha band (595 nm) starting from the fully reduced (a2+a32+-CO) and MV (a3+a32+-CO) COcomplexes. In the MV complex only, a significant spectral evolution with a nanosecond time constant was observed both in alpha and in Soret spectral regions that can be fully ascribed to electron equilibration (a3+a32+a2+a33+). We suggest that the intrinsic time constant of reduction of heme a3 by heme a is on this time scale. The result will be discussed in the framework of conflicting theoretical predictions. An additional remarkable observation is that the CO-dissociation spectrum from heme a3 depends on the redox state of heme a. This finding adds to the notion that can in principle not be treated as spectrally independent entities. This observation may relate to the strong variation in spectral decompositions using various methods.
• Ligand binding dynamics in heme-based oxygen sensor FixL studied by ultrafast spectroscopy
  
  • Jasaitis Audrius
  • Balland V.
  • Bouzir-Sima L.
  • Lambry J.-C.
  • Liebl Ursula
  • Vos Marten H.
  , 2004, 1658 (1-2, supplement), pp.256. Heme-based oxygen sensors are part of ligand specific two-component regulatory systems. FixL from Bradyrhizobium japonicum is an example of such a sensor. In this protein the binding of oxygen to the heme in the receptor domain causes changes in an associated enzymatic domain that eventually regulates transcription factors. We used femtosecond absorption spectroscopy to investigate the binding dynamics of O2, CO and NO and the characteristics of the first signaling intermediate upon oxygen release with wild type and mutant forms of FixL. In wild-type specifically, the oxygen binding kinetics in FixL are extremely fast and efficient. Within 20 ps, 90% of oxygen is already recombined in a geminate way and only 10% of the dissociated oxygen leaves the heme pocket, showing that the heme pocket acts as an oxygen trap [1]. The heme spectrum after photolysis of oxygen is perturbed compared to the steady state oxygen-binding spectrum, which shows the residual interaction with the dissociated ligand. Arginine 220 is located in the heme pocket and is proposed to stabilize the bound ligand and participate in the signal transduction [2]. Substitution of R220 with isoleucine, glutamic acid and glutamate all had similar effects: It strongly decreased the part of fast oxygen geminate recombination pointing at an important role of this residue in oxygen trapping. Also the residual interaction with dissociated oxygen is lost as witnessed by the less perturbed dissociation spectrum. The steady-state heme conformation and ligand characteristics are similar in FixL, the oxygen sensor, and myoglobin, the oxygen storage protein. In the heme pocket of Mb a histidine can form a hydrogen bond to the ligand. We prepared the R220H mutant of FixL in which the oxygen binding kinetics became biphasic. In addition to the fast phase of oxygen binding appeared a slower, nanosecond component. The amplitude of each phase was about 50% of the total amplitude. The binding of CO also was dramatically affected. In the R220H mutant about 50% of carbon monoxide rebinds geminately with a time constant 2.4 ns, which is observed nor in WT FixL nor in Mb, where only bimolecular binding of CO occurs. The ensemble of our data indicate that R220 plays a key role in transmission of the signal within the heme domain. Preliminary MD simulations support this view
• Fourier transform measurement of two-photon excitation spectra: Applications to microscopy and quantum control
  
  • Kubarych Kevin J.
  • Ogilvie Jennifer P.
  • Alexandrou Antigoni
  • Joffre Manuel
  , 2004, 79, pp.575-577. We report a novel Fourier transform method of measuring two-photon excitation spectra. We demonstrate this method using a simple dye system and discuss its applications in two-photon fluorescence microscopy and quantum control. (10.1007/3-540-27213-5_176)
  DOI : 10.1007/3-540-27213-5_176
• Fourier transform measurement of two-photon excitation spectra: Applications to microscopy and quantum control
  
  • Kubarych Kevin J.
  • Ogilvie Jennifer P.
  • Alexandrou Antigoni
  • Joffre Manuel
  , 2005, pp.ThD32. We report a novel Fourier transform method of measuring two-photon excitation spectra. We demonstrate this method using a simple dye system and discuss its applications in two-photon fluorescence microscopy and quantum control. © 2004 Optical Society of America
• Ultrafast polarization and vibrational motions in bacteriorhodopsin studied by coherent infrared emission spectroscopy
  
  • Colonna Anne
  • Groma Geza
  • Lambry Jean-Christophe
  • Joffre Manuel
  • Martin Jean-Louis
  • Vos Marten H.
  , 2005, 79, pp.616-618. The primary events in bacteriorhodopsin are investigated by coherent infrared emission spectroscopy of oriented purple membranes. Long-lived vibrational motions involving charge displacements are observed following sudden (<11 fs) macroscopic membrane polarization appearing upon visible excitation. (10.1007/3-540-27213-5_188)
  DOI : 10.1007/3-540-27213-5_188
• Photophysics of horse heart cytochrome c: time-resolved resonance Raman and transient absorption studies
  
  • Cianetti Simona
  • Kruglik Sergei G.
  • Négrerie Michel
  • Martin Jean-Louis
  • Vos Marten H.
  , 2004, pp.ThD28. Transient resonant Raman studies with 0.6 ps time resolution demonstrate that the methionine is photodissociated from ferrous, but not from ferric cytochrome c. Heme cooling and ligand recombination occur in 1.8 and 5 ps respectively. © 2004 Optical Society of America
• The CO oscillator as a probe of ligand dissociation dynamics in myoglobin
  
  • Ogilvie Jennifer P.
  • Polack Thomas
  • Franzen Stefan
  • Vos Marten H.
  • Joffre Manuel
  • Martin Jean-Louis
  • Alexandrou Antigoni
  , 2004, 79, pp.634. We report spectrally-integrated, visible-pump, mid-infrared probe studies of the CO ligand in myoglobin. Supported by density functional calculations, we find that the CO oscillator strength and frequency changes occur on disparate timescales following dissociation. (10.1007/3-540-27213-5_194)
  DOI : 10.1007/3-540-27213-5_194
• Microscopie non linéaire : chiralité et génération de second harmonique
  
  • Boulesteix Thierry
  , 2004. Depuis 1990, la microscopie non linéaire de fluorescence excitée à deux photons (TPEF) ou de génération de second harmonique (SHG) a insufflé un nouvel élan à la microscopie optique. Il est possible de réaliser de l’imagerie fonctionnelle tridimensionnelle de tissus épais vivants ou de cellule. Le contraste provient soit de colorants optimisés pour l’imagerie non linéaire (contraste exogène), soit de protéines naturellement présentes dans les tissus comme l’élastine ou le collagène (contraste endogène). Nous abordons la microscopie non linéaire de ces deux points de vue, essentiellement en SHG mais aussi en TPEF. Notre travail sur les colorants pour la microscopie SHG s’appuie sur l’étude optique non linéaire des mécanismes intervenant dans l’activité optique des molécules chirales (la chiralité est la propriété d’un objet de ne pas être superposable à son image dans un miroir). La chiralité du colorant doit permettre d’améliorer l’imagerie membranaire de second harmonique quand les molécules se répartissent de part et d’autre de la membrane dans un arrangement centro-symétrique. Nous démontrons que le signal est conservé dans cette géométrie uniquement pour une chiralité par couplage excitonique. Dans ce but, nous avons travaillé sur un colorant synthétisé par le Laboratoire de Chimie de l’ENS de Lyon qui possède ce type de chiralité : l’ASTB (base de Troger substituée par deux acridines). Le travail sur ce colorant s’effectue alors dans deux directions, d’une part tester l'extension du modèle des oscillateurs couplés aux effets chiroptiques non-linéaires et d’autre part, montrer que ce colorant possède le type de chiralité optimal pour exalter le signal de second harmonique membranaire. La mesure résolue en polarisation du signal de second harmonique réfléchi par un film mince de ce colorant permet de valider notre modèle. Des vésicules artificielles mimant les membranes cellulaires permettent d’étudier son comportement comme colorant membranaire. Nous étudions et utilisons deux sources de contraste endogènes : le collagène (source de SHG) et l’élastine (source de TPEF). Après caractérisation des propriétés optiques non linéaires de ces deux protéines, nous montrons comment la microscopie non linéaire combinée de TPEF et de SHG peut remplacer avantageusement l’histologie classique. Nous démontrons la faisabilité d’une étude morphologique sur du tissu artériel épais vivant de Rat. Nous mettons alors en évidence les effets du lindane (un insecticide très répandu) sur le système cardio-circulatoire. L’étude montre de nombreuses altérations de l’élastine du tissu cardiaque tant au niveau de l’aorte que de l’artère carotide. Ces altérations se retrouvent, en partie, dans les artères d’animaux non traités au lindane mais descendant de père traité avec une dose résiduelle de toxique. Ce travail montre l’existence d’effets de l’insecticide sur la descendance. Nous réalisons la première étude nanotoxinologique en microscopie non linéaire à partir du signal de second harmonique des filaments de myosine. Nous mesurons une contracture au repos de cellules atriales de grenouille soumises à une toxine (la saxitoxine), avec une précision de 20 nm.
• Coherent vibrational climbing in carboxy-hemoglobin
  
  • Ventalon Cathie
  • Fraser James M.
  • Vos Marten H.
  • Alexandrou Antigoni
  • Martin Jean-Louis
  • Joffre Manuel
  , 2005, 79, pp.628-630. We demonstrate vibrational climbing up to level v=6 in carboxyhemoglobin by use of intense negatively-chirped infrared pulses. This technique gave new spectroscopic insight into carboxy-hemoglobin, such as transition frequencies and dephasing times up to the v=6 to v=7 vibrational transition. (10.1007/3-540-27213-5_192)
  DOI : 10.1007/3-540-27213-5_192
• Coherent vibrational climbing in carboxy-hemoglobin
  
  • Ventalon Cathie
  • Fraser James M.
  • Vos Marten H.
  • Alexandrou Antigoni
  • Martin Jean-Louis
  • Joffre Manuel
  , 2004, pp.MC5. We demonstrate vibrational climbing up to level v=6 in carboxyhemoglobin by use of intense negatively-chirped infrared pulses. We measure the position and width of all absorption lines, and the lifetimes of the first excited states. © 2004 Optical Society of America
• Femtosecond intermolecular energy transfer in pure water
  
  • Amir Wafa
  • Gallot Guilhem
  • Hache François
  , 2004, pp.ItuL4. A new method is used to experimentally study pure water. Intermolecular energy transfer was found, with a spectral diffusion time of 110 fs, in agreement with models for pure water. © 2004 Optical Society of America.
• From The Cover: An aminoacyl-tRNA synthetase-like protein encoded by the Escherichia coli yadB gene glutamylates specifically tRNAAsp
  
  • Dubois Daniel
  • Blaise Mickaël
  • Becker Hubert F.
  • Campanacci Valérie
  • Keith Gerard
  • Cambillau Christian
  • Lapointe Jacques
  • Kern Daniel
  • Becker D.
  • Giegé Richard
  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, National Academy of Sciences, 2004, 101 (20), pp.7530-7535. The product of the Escherichia coli yadB gene is homologous to the N-terminal part of bacterial glutamyl-tRNA synthetases (GluRSs), including the Rossmann fold with the acceptor-binding domain and the stem-contact fold. This GluRS-like protein, which lacks the anticodon-binding domain, does not use tRNA(Glu) as substrate in vitro nor in vivo, but aminoacylates tRNA(Asp) with glutamate. The yadB gene is expressed in wild-type E. coli as an operon with the dksA gene, which encodes a protein involved in the general stress response by means of its action at the translational level. The fate of the glutamylated tRNA(Asp) is not known, but its incapacity to bind elongation factor Tu suggests that it is not involved in ribosomal protein synthesis. Genes homologous to yadB are present only in bacteria, mostly in Proteobacteria. Sequence alignments and phylogenetic analyses show that the YadB proteins form a distinct monophyletic group related to the bacterial and organellar GluRSs (alpha-type GlxRSs superfamily) with ubiquitous function as suggested by the similar functional properties of the YadB homologue from Neisseria meningitidis. (10.1073/pnas.0401634101)
  DOI : 10.1073/pnas.0401634101
• Ultrafast time resolved spectroscopy of protons in water: An experimental study
  
  • Amir Wafa
  • Gallot Guilhem
  • Hache François
  , 2004, IQEC Poster Session II (IWA), pp.IWA15. We present here the first measurement of the femtosecond dynamics of protons in liquid water [Eigen-type H3O+(H 2O)3] by vibrational time resolved spectroscopy. The proton relaxation occurs in less than 200 fs. © 2004 Optical Society of America.
• Femtosecond intermolecular energy transfer in pure water
  
  • Amir Wafa
  • Gallot Guilhem
  • Hache François
  , 2004, pp.ITul4. A new method is used to experimentally study pure water. Intermolecular energy transfer was found, with a spectral diffusion time of 110 fs, in agreement with models for pure water. © 2004 Optical Society of America.
• Ascension vibrationnelle dans les hémoprotéines à l'aide d'impulsions infrarouges intenses à dérive de fréquence
  
  • Ventalon Cathie
  , 2004. La compréhension des réactions biochimiques qui se déroulent au sein des protéines est un enjeu fondamental de la biologie actuelle. Dans ce travail, nous nous sommes principalement intéressés aux premières étapes de ces réactions, qui se produisent à l'échelle de la centaine de femtosecondes. Traditionnellement, l'étude de ces premières étapes se fait à l'aide d'impulsions ultracourtes dans le domaine visible ou ultraviolet : ces impulsions font passer la molécule sur un état électronique excité, ce qui permet de déclencher la réaction étudiée de manière ultrarapide et très efficace. Dans ce travail, nous avons exploré une nouvelle voie d'excitation des molécules biologiques : nous avons utilisé des impulsions infrarouges, de manière à placer l'énergie directement dans les vibrations de la molécule. Cette technique permet théoriquement d'explorer la surface de potentiel de la protéine loin de sa région harmonique, et même d'approcher l'état de transition de la réaction catalysée par la protéine. Pour communiquer le plus d'énergie possible à la molécule, nous avons utilisé des impulsions infrarouges intenses et à dérive de fréquence qui permettent de gravir efficacement l'échelle vibrationnelle considérée. Dans une première étape, nous avons engendré des impulsions infrarouges intenses dont l'énergie est de quelques microjoules et le spectre s'étend sur 170 cm-1 environ. Nous avons ensuite caractérisé ces impulsions par diverses méthodes : nous avons notamment mesuré leur phase spectrale au moyen d'une technique de HOT SPIDER temporel, ce qui constitue la première mesure de phase spectrale autoréférencée pour des impulsions centrées autour de 10 µm. Dans une seconde étape, nous avons utilisé ces impulsions infrarouges pour exciter la vibration d'une molécule de CO liée à la myoglobine, puis à l'hémoglobine. Dans ce dernier cas, nous avons démontré l'ascension vibrationnelle de la molécule de CO jusqu'au 7ème niveau excité : nous avons ainsi réalisé la première expérience d'ascension vibrationnelle dans une molécule biologique ou plus généralement dans une macromolécule. Cette technique d'excitation nous a permis d'obtenir des données spectroscopiques nouvelles sur la carboxy-hémoglobine telles que la position et la largeur des raies d'absorption des différentes transitions vibrationnelles, les temps de vie des niveaux excités ainsi que la présence d'une anharmonicité électrique importante.
• In vivo micro-dissection and live embryo imaging by two-photon microscopy to study Drosophila melanogaster early developement
  
  • Supatto W.
  • Brouzès E.
  • Farge Emmanuel
  • Beaurepaire Emmanuel
  , 2004, 5463. Animal embryo development exhibits a complex choreography of cell movements highly regulated both in time and space. This sequence of morphogenetic movements is initiated at gastrulation and is tightly controlled by a cascade of developmental gene expression. We have recently reported that developmental gene expression can in turn be mechanically regulated by morphogenetic movements during Drosophila melanogaster early development[1]. In order to study this phenomenon of mechanically induced gene expression, it is necessary to develop new techniques of in vivo investigation. We show that the combination of femtosecond pulse intratissue surgery and two-photon-excitation fluorescence (2PEF) microscopy is a powerful tool for (i) disrupting natural morphogenetic movements and (ii) imaging native and disrupted morphogenetic movements during Drosophila development, (i) First, non-linear-absorption-mediated photo-disruption makes it possible to perform controlled intra-vital micro-dissections resulting in the modulation of morphogenetic movements and subsequent mechano-sensitive gene expression, (ii) Second, in vivo 2PEF microscopy of transgenic GFP systems appears to be an excellent technique for long-term in vivo imaging of the complex morphogenetic movements involved in normal or perturbed Drosophila gastrulation. Together, these two techniques provide a powerful novel approach to study embryo development. © (2004) COPYRIGHT SPIE--The International Society for Optical Engineering (10.1117/12.545453)
  DOI : 10.1117/12.545453
• Vibrational climbing in carboxyhemoglobin by use of stretched infrared pulses.
  
  • Ventalon Cathie
  • Fraser James M.
  • Vos Marten H.
  • Alexandrou Antigoni
  • Martin Jean-Louis
  • Joffre Manuel
  , 2004, pp.PHYS 79. Vibrational ladder climbing using infrared ultrashort laser pulses is an attractive approach for direct control of the nuclear motion of molecules. This technique relies on the use of infrared pulses which need to be negatively chirped in order to take into account the anharmonicity of the addressed molecular vibration [1]. Vibrational climbing has been demonstrated previously in different systems such as W(CO)6 [2], NO [3] and Cr(CO)6 [4], with the demonstration of molecular dissociation in the latter case. We report here on the demonstration of vibrational climbing in a biological system, carboxyhemoglobin (HbCO). The CO vibration is selectively addressed using stretched mid-infrared pulses of energy 2 mJ centered at a wavenumber of 1900 cm-1 with a spectral width of 150 cm-1 (repetition rate 1 kHz). While a positively chirped pulse results in the excitation of the first two vibrational states only, a negatively chirped pulse allows the excitation of states up to v=6. This technique opens a new approach to the excitation of hemoproteins, using infrared instead of UV pulses.
• Excited-state properties of flavin radicals in flavoproteins: Femtosecond spectroscopy of DNA photolyase, glucose oxidase, and flavodoxin
  
  • Pan Jie
  • Byrdin Martin
  • Aubert Corinne
  • Eker André P. M.
  • Brettel Klaus
  • Vos Marten H.
  Journal of Physical Chemistry B, American Chemical Society, 2004, 108 (28), pp.10160. In isolated, catalytically inactive, DNA photolyase from Escherichia coli (E. coli), the flavin adenine dinucleotide cofactor is in its neutral radical state FAD?. It can be activated by a unique light-induced reduction of the flavin, a process initiated by the formation of the excited-state FAD?*. As the photophysical properties of this state are essentially unknown, we performed a comparative characterization by femtosecond transient absorption spectroscopy of FAD?* in DNA photolyase from E. coli and glucose oxidase from Aspergillus niger, and of the excited neutral radical flavin mononucleotide (FMN?*) in flavodoxin from Desulfovibrio gigas. In contrast to photolyase, in glucose oxidase and flavodoxin no electron-transfer products are observed after selective excitation of the flavin radical. In glucose oxidase, FAD?* decays to the ground state in 59 ± 5 ps, close to the 80-ps intrinsic lifetime of the excited state in photolyase, and we discuss that the intrinsic lifetime of the excited state of flavin radical in protein environment is in the 50-80 ps range. FMN?* in flavodoxin decays much faster (2.3 ± 0.3 ps), possibly because of quenching by formation of a very short-lived (INF 0.7 ps) electron-transfer intermediate. Spectroscopically, the excited state of FAD? in photolyase displays a pronounced spectral feature that is absent in the other systems studied. Further characterization by polarized photoselection experiments identifies the feature as an additional induced absorption band at ~ 550 nm superimposed on the ground-state bleaching signal. In view of the unique U-shape configuration of FAD in photolyase, we suggest it to reflect a flavin-adenine charge-transfer interaction.