Publications

2006

• Transfert de ligand dans la cytochrome c oxydase observé par des expériences femtosecondes infrarouge intégrées et résolues spectralement.
  
  • Treuffet Johanne
  , 2006. L'étude dynamique des hémoprotéines, indispensable à la compréhension du fonctionnement de leur site actif, a considérablement progressé grâce aux expériences de spectroscopie. Nous avons étudié dans ce cadre le transfert du ligand CO au sein du site actif bimétallique de la cytochrome c oxydase, du Fer de l'hème à l'atome de Cuivre, par spectroscopie femtoseconde infrarouge. Les expériences dans l'infrarouge permettent d'analyser les caractéristiques vibrationnelles des molécules et de suivre ainsi directement le transfert du ligand par l'intermédiaire de sa signature vibrationnelle. Afin de résoudre le transfert étudié, qui se produit sur une échelle subpicoseconde, l'expérience doit avoir une résolution femtoseconde. Deux expériences pompe-sonde femtoseconde dans le domaine infrarouge, une expérience intégrée spectralement et une expérience résolue spectralement, ont été mises en place. Ces deux expériences ont apporté des informations complémentaires sur le transfert du ligand CO au sein du site actif de la cytochrome c oxydase. Dans le cas de l'expérience intégrée spectralement, un signal supplémentaire dû à l'absorption des molécules d'hème a été identifié et soustrait aux cinétiques afin d'isoler le signal induit par le transfert du CO. Le temps caractéristique de ce transfert a ainsi pu être évalué à 400 fs. Lors de l'expérience résolue spectralement, l'évolution des raies d'absorption du CO présente un décalage de 200 fs qui suggère une composante balistique dans le transfert. L'expérience résolue spectralement a été réalisée à l'aide d'une nouvelle technique de mesure du spectre infrarouge par conversion vers le visible, développée au laboratoire. Cette technique, qui offre un meilleur rapport signal sur bruit et une meilleure résolution que les approches concurrentes, a permis d'acquérir un ensemble de spectres différentiels suffisant pour valider expérimentalement une nouvelle technique de filtrage des oscillations de cohérence. Nous avons réalisé des simulations de dynamique moléculaire qui modélisent le transfert du ligand CO dans la cytochrome c oxydase, du Fer de l'hème vers l'atome de Cuivre. Ces simulations sont en bon accord avec les résultats expérimentaux et ont montré que le trajet emprunté par le CO lors de son transfert est reproductible, ce qui corrobore un transfert balistique.
• Etude des hémoprotéines senseurs à oxygène bactériens FixL et Dos.
  
  • Bouzhir Latifa
  , 2006. L'adaptation à l'environnement est essentielle pour la survie de tout organisme, des bactéries à l'Homme. Pour s'adapter rapidement aux milieux extrêmement variés et aux fluctuations environnementales, les procaryotes ont adopté des systèmes élaborés, capables de détecter et de réagir aux molécules vitales ou toxiques à leur développement. Outre les facteurs de stress tels que température, pH, la cellule doit s'adapter aux variations de concentration de nutriments et de gaz diatomiques. En effet, la modification d'un ou plusieurs paramètres de l'environnement déclenche une altération de l'expression des gènes, permettant des changements dans la composition protéique et ainsi une adaptation du métabolisme aux nouvelles conditions. Un paramètre environnemental particulièrement essentiel est le taux d'oxygène. Le passage à la vie limitée en oxygène, ou inversement, a été particulièrement étudié chez les bactéries. Celles-ci disposent de plusieurs chaînes de transporteurs d'électrons et utilisent à tout moment celle qui leur est la plus favorable sur le plan énergétique. En présence d'oxygène, accepteur d'électrons le plus favorable, les bactéries utilisent la respiration oxygènée, qui se caractérise par la synthèse d'enzymes du type cytochrome oxydase, alors qu'en absence d'oxygène ou en condition de basse pression d'oxygène (ou hypoxie), elles mettent en place la respiration par le nitrate, caractérisée par la synthèse de quinones respiratoires comme intermédiaires (Pelmont J., 1993). Le transporteur final de la voie " nitrate " est la nitrate réductase, enzyme clé inhibée par l'oxygène. La présence d'oxygène diatomique impose donc aux bactéries de profonds changements de leur métabolisme, soit parce qu'elles doivent réajuster leur système de production d'énergie, soit parce qu'elles doivent lutter contre la toxicité de l'oxygène ; pour cela elles disposent de tout un arsenal enzymatique. La connaissance des processus biochimiques par l'intermédiaire desquels ces adaptations sont réalisées est essentielle à la compréhension du fonctionnement cellulaire.
• Experimental evidence of percolation phase transition in surface plasmons generation
  
  • Masson Jean-Baptiste
  • Gallot Guilhem
  , 2006. Carrying digital information in traditional copper wires is becoming a major issue in electronic circuits. Optical connections such as fiber optics offers unprecedented transfer capacity, but the mismatch between the optical wavelength and the transistors size drastically reduces the coupling efficiency. By merging the abilities of photonics and electronics, surface plasmon photonics, or 'plasmonics' exhibits strong potential. Here, we propose an original approach to fully understand the nature of surface electrons in plasmonic systems, by experimentally demonstrating that surface plasmons can be modeled as a phase of surface waves. First and second order phase transitions, associated with percolation transitions, have been experimentally observed in the building process of surface plasmons in lattice of subwavelength apertures. Percolation theory provides a unified framework for surface plasmons description.
• Enhanced release of nitric oxide from endothelial cells under anoxia
  
  • Vanin A. F.
  • Slama-Schwok Anny
  • Bevers L. M.
  • van Faassen E.
  , 2006, 43, pp.548. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is capable of releasing free NO from nitrite in vitro under anoxiaa. Therefore the anoxic nitrite reductase pathway might provide a significant alternative source of NO for tissues under acute hypoxia. This hypothesis was tested by NO trapping in cultured endothelial (bEND.3) cells using iron-dithiocarbamate traps and EPR. Yields (in pmol) from NO trapping in 7.5*106 endothelial cells for 20 min at 37°C. Oxia is in an atmosphere with 5% CO 2 and 20% O 2 , anoxia is under argon. The supplements were added to medium.
• Spatial distribution and quantitative analysis of extracellular matrix remodelling in lung fibrosis using multiphoton microscopy
  
  • Fabre Aude
  • Pena Ana-Maria
  • Débarre Delphine
  • Marchal-Somme J.
  • Crestani Bruno
  • Martin Jean-Louis
  • Hénin D.
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Schanne-Klein Marie-Claire
  , 2006. The micro- and macro- organization of collagen during fibrotic processes is usually characterized by 2D assessment using histochemical stains on selected slides such as Masson's Trichrome or Sirius Red. However, these staining methods are limited to semi quantitative evaluation on restricted surfaces. Quantitative evaluation of collagen contents, such as Hydroxyproline or Sircol assays, performed on lung homogenates requires large amounts of tissue, are time consuming and do not give the spatial distribution of collagen. Non linear multimodal, multiphoton microscopy provides novel insights into collagen deposition in tissues. In this study, the micrometerscale three-dimensional spatial distribution of fi brosis was characterized in normal mouse lung (n=5) and in the murine model of bleomycininduced lung fi brosis (n=5) by second harmonic generation (SHG) of fi brillar collagen, using C56Bl/6 mice at day 14 post intra-tracheal instillation of bleomycin, 80 µg in 50 µl of 0.9 % sterile saline.
• Microscopie par génération de troisième harmonique appliquée à la biologie.
  
  • Débarre Delphine
  , 2006. Cette thèse a porté sur le développement pour la biologie de la microscopie par génération de troisième harmonique (THG), qui permet la visualisation sans marquage de cellules et de tissus avec une résolution sub-micrométrique. Son application en biologie était jusqu'à présent limitée par le manque d'études du mode de création du signal dans l'échantillon, des sources de contrastes biologiques endogènes ainsi que de la phototoxicité induite. Le travail présenté ici a essentiellement porté sur ces trois questions. Nous avons d'abord étudié théoriquement et expérimentalement l'influence de la structure de l'échantillon et de la focalisation du faisceau excitateur sur le signal THG. Nous avons montré que l'imagerie THG agit sur l'échantillon comme un filtre passe! -bande pour les fréquences spatiales et qu'ajuster la focalisation de l'excitation permet de moduler la visibilité de structures au sein d'un système complexe selon leur forme. Par ailleurs, nous avons caractérisé les propriétés optiques de différents liquides biologiques, qui prédisent qu'un corps lipidique dans un environnement aqueux doit constituer une source efficace de signal intracellulaire. Nous avons démontré que de telles structures peuvent effectivement être suivies et quantifiées par microscopie THG dans de nombreux types de tissus biologiques non marqués, ouvrant la voie à des applications en physiopathologie. Finalement, nous avons appliqué la microscopie THG à la visualisation in vivo et sans marquage du développement embryonnaire précoce chez la drosophile. Sur ce modèle, nous avons étudié les mécanismes de phototoxicité liés à l'imagerie THG et démontré la possibilité de visualiser les embryons en 3D sans perturbation du développement et de quantifier les mouvements morphogénétiques à partir des séquences obtenues.
• Génération de seconde harmonique par le collagène et application à l'étude de fibroses par microscopie multiphoton.
  
  • Pena Ana-Maria
  , 2006. La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.
• First evidence of the implication of nitric oxide in a mouse model for ciguatera fish poisoning
  
  • Pauillac S.
  • Vernel-Pauillac F.
  • Kumar-Roine S.
  • Sauviat Martin-Pierre
  • Benoit Evelyne
  • Chinain M.
  • Laurent Dominique
  , 2007, pp.316-318. The involvement of the nitric oxide (NO) pathway in ciguatera fish poisoning (CFP) has been investigated, in vitro and in vivo, in a ciguatoxin (CTX)/mouse model. The induction of inducible nitric oxide synthase (iNOS) synthesis at the mRNA level was kinetically measured using a real-time PCR protocol based on the LightCycler® technology. CTX-pulsed Neuro-2a cells (1 ng/mL) and peripheral blood mononuclear cells from CTXinjected mice (1ng/g), were demonstrated to express iNOS in a time-dependent manner. This strongly suggests that NO might be responsible for certain ciguatera symptoms (e.g. hypotension, allergenic effects and Chronic Fatigue Syndrome) which could not be solely explained by the activation of voltage-gated sodium channels. This hypothesis is supported by the observation that the most currently used drugs for the treatment of CFP are free radical scavengers. In conclusion, the implication of NO in CFP paves the way for new therapies for both occidental and traditional medicines, together with new CTXs detection and clinical diagnostic tools.
• 1-kHz table-top ultrashort hard x-ray source for time-resolved x-ray protein
  
  • Bonvalet Adeline
  • Darmon Adeline
  • Lambry Jean-Christophe
  • Martin Jean-Louis
  • Audebert Patrick
  Optics Letters, Optical Society of America - OSA Publishing, 2006, 31 (18), pp.2753. We describe a compact, reliable, and high-average-power femtosecond x-ray source and its first application to diffraction on protein crystal. The setup relies on a homemade Ti: sapphire system delivering 12 mJ at a 1 kHz repetition rate, associated with a small vacuum chamber especially designed for laser-plasma interaction and x-ray applications. This device allows the generation of 5×109 photons/s/sr at 8 keV and optimized x-ray irradiation of the studied sample, which can be placed close to the source. We present the diffraction pattern of a protein crystal in a divergent beam geometry, which is a first step to a subpicosecond x-ray diffraction experiment. (10.1364/OL.31.002753)
  DOI : 10.1364/OL.31.002753
• Catalytic mechanism and structure of viral flavin-dependent thymidylate synthase ThyX.
  
  • Graziani Sébastien
  • Bernauer Julie
  • Skouloubris Stéphane
  • Graille Marc
  • Zhou Cong-Zhao
  • Marchand Christophe
  • Decottignies Paulette
  • van Tilbeurgh Herman
  • Myllykallio Hannu
  • Liebl Ursula
  Journal of Biological Chemistry, American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 281 (33), pp.24048-57. By using biochemical and structural analyses, we have investigated the catalytic mechanism of the recently discovered flavin-dependent thymidylate synthase ThyX from Paramecium bursaria chlorella virus-1 (PBCV-1). Site-directed mutagenesis experiments have identified several residues implicated in either NADPH oxidation or deprotonation activity of PBCV-1 ThyX. Chemical modification by diethyl pyrocarbonate and mass spectroscopic analyses identified a histidine residue (His53) crucial for NADPH oxidation and located in the vicinity of the redox active N-5 atom of the FAD ring system. Moreover, we observed that the conformation of active site key residues of PBCV-1 ThyX differs from earlier reported ThyX structures, suggesting structural changes during catalysis. Steady-state kinetic analyses support a reaction mechanism where ThyX catalysis proceeds via formation of distinct ternary complexes without formation of a methyl enzyme intermediate. (10.1074/jbc.M600745200)
  DOI : 10.1074/jbc.M600745200
• Novel applications of broadband excitation to multiphoton microscopy
  
  • Ogilvie Jennifer P.
  • Débarre Delphine
  • Solinas Xavier
  • Martin Jean-Louis
  • Alexandrou Antigoni
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Joffre Manuel
  , 2006, pp.ThC6. We report a single-laser time-resolved Fourier transform implementation of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy that provides high resolution spectrally-resolved images. We also demonstrate coherent-control-based two-photon fluorescence microscopy for selective fluorescence excitation in live organisms. © 2006 Optical Society of America (10.1364/UP.2006.ThC6)
  DOI : 10.1364/UP.2006.ThC6
• Mechanism of radical transfer during photoactivation of the flavoprotein DNA photolyase
  
  • Lukacs Andras
  • Vos Marten H.
  • Eker André P. M.
  • Byrdin Martin
  • Brettel Klaus
  , 2006, pp.MH24. Ultrafast transient absorption experiments on mutant DNA photolyase imply that radical transfer along a chain of tryptophan residues is substantially faster than the ~30-ps photo-induced electron-transfer event initiated by excitation of the radical flavin FADH. © 2006 Optical Society of America (10.1364/UP.2006.MH24)
  DOI : 10.1364/UP.2006.MH24
• Mechanism of Radical Transfer during Photoactivation of the Flavoprotein DNA Photolyase
  
  • Lukacs Andras
  • Vos Marten H.
  • Eker A. P. M.
  • Byrdin M.
  • Brettel Klaus
  , 2007, 88, pp.507-509. Ultrafast transient absorption experiments on mutant DNA photolyase imply that radical transfer along a chain of tryptophan residues is substantially faster than the ∼30-ps photo-induced electron-transfer event initiated by excitation of the radical flavin FADH*. (10.1007/978-3-540-68781-8_164)
  DOI : 10.1007/978-3-540-68781-8_164
• Ultrafast conformational changes in carboxymyoglobin studied by time-resolved circular dichroism
  
  • Dartigalongue Thibault
  • Hache François
  , 2006, pp.WE7. Conformational changes following photodissociation of carboxy-myoglobin are studied by time-resolved circular dichroism. We observe a drop of the signal which builds up in 10 ps and relaxes in 100 ps. (10.1364/UP.2006.WE7)
  DOI : 10.1364/UP.2006.WE7
• A new concept for the role of nitrite in the vasculature: eNOS as nitrite reductase
  
  • Slama-Schwok Anny
  • Vanin A.
  • Martasek P.
  • van Faassen E.
  , 2006, 14 (4), pp.69. (10.1016/j.niox.2006.04.226)
  DOI : 10.1016/j.niox.2006.04.226
• Allosteric activators modulate the Fe-His bond in soluble guanylate cyclase and in Clostridium botulinum NO-sensor
  
  • Négrerie Michel
  • Yoo Byung-Kuk
  • Lamarre Isabelle
  • Rappaport Fabrice
  • Nioche Pierre
  • Martin Jean-Louis
  , 2010, pp.S15. (10.1016/j.niox.2010.05.038)
  DOI : 10.1016/j.niox.2010.05.038
• Ultrafast heme dynamics in ferrous versus ferric cytochrome c studied by time-resolved resonance Raman and transient absorption spectroscopy.
  
  • Négrerie Michel
  • Cianetti Simona
  • Vos Marten H.
  • Martin Jean-Louis
  • Kruglik Sergei G.
  Journal of Physical Chemistry B, American Chemical Society, 2006, 110 (25), pp.12766-12781. Cytochrome c (Cyt c) is a heme protein involved in electron transfer and also in apoptosis. Its heme iron is bisaxially ligated to histidine and methionine side chains and both ferric and ferrous redox states are physiologically relevant, as well as a ligand exchange between internal residue and external diatomic molecule. The photodissociation of internal axial ligand was observed for several ferrous heme proteins including Cyt c, but no time-resolved studies have been reported on ferric Cyt c. To investigate how the oxidation state of the heme influences the primary photoprocesses, we performed a comprehensive comparative study on horse heart Cyt c by subpicosecond time-resolved resonance Raman and femtosecond transient absorption spectroscopy. We found that in ferric Cyt c, in contrast to ferrous Cyt c, the photodissociation of an internal ligand does not take place, and relaxation dynamics is dominated by vibrational cooling in the ground electronic state of the heme. The intermolecular vibrational energy transfer was found to proceed in a single phase with a temperature decay of 7 ps in both ferric and ferrous Cyt c. For ferrous Cyt c, the instantaneous photodissociation of the methionine side chain from the heme iron is the dominant event, and its rebinding proceeds in two phases, with time constants of 5 and 16 ps. A mechanism of this process is discussed, and the difference in photoinduced coordination behavior between ferric and ferrous Cyt c is explained by an involvement of the excited electronic state coupled with conformational relaxation of the heme. (10.1021/jp0559377)
  DOI : 10.1021/jp0559377
• Ultrashort laser pulses and ultrashort electron bunches generated in relativistic laser-plasma interaction
  
  • Faure Jérôme
  • Glinec Y.
  • Gallot Guilhem
  • Malka Victor
  Physics of Plasmas, American Institute of Physics, 2006, 13 (5), pp.056706. An experimental study of the interaction of ultrashort laser pulses with underdense plasmas in the relativistic regime is presented. A parameter regime of particular interest was found: the so-called bubble regime. In this regime, the laser pulse is focused to relativistic intensities and its pulse duration is comparable to or shorter than the plasma period. A wealth of physical phenomena occurs for such physical parameters. These phenomena have multiple signatures which have been investigated experimentally: (i) the generation of a high quality electron beam (high energy, very collimated, quasimonoenergetic energy distribution); (ii) the laser pulse temporal shortening in nonlinear plasma waves. In addition, experimental results suggest that the electron beam produced in this way has temporal structures shorter than 50 fs. (10.1063/1.2180727)
  DOI : 10.1063/1.2180727
• Fourier-transform coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.
  
  • Ogilvie Jennifer P.
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Alexandrou Antigoni
  • Joffre Manuel
  Optics Letters, Optical Society of America - OSA Publishing, 2006, 31 (4), pp.480-2. We report a novel Fourier-transform-based implementation of coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. The method employs a single femtosecond laser source and a Michelson interferometer to create two pulse replicas that are fed into a scanning multiphoton microscope. By varying the time delay between the pulses, we time-resolve the CARS signal, permitting easy removal of the nonresonant background while providing high resolution, spectrally resolved images of CARS modes over the laser bandwidth (approximately 1500 cm(-1)). We demonstrate the method by imaging polystyrene beads in solvent. (10.1364/OL.31.000480)
  DOI : 10.1364/OL.31.000480
• Insight into Framework Destruction in Ultramarine Pigments
  
  • del Federico Eleonora
  • Shöfberger Wolfgang
  • Schelvis Johannes
  • Kapetanaki Sofia
  • Tyne Lindsey
  • Jerschow Alexej
  Inorganic Chemistry, American Chemical Society, 2006, 45 (3), pp.1270-1276. (10.1021/ic050903z)
  DOI : 10.1021/ic050903z
• Use of coherent control for selective two-photon fluorescence microscopy in live organisms.
  
  • Ogilvie Jennifer P.
  • Débarre Delphine
  • Solinas Xavier
  • Martin Jean-Louis
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Joffre Manuel
  Optics Express, Optical Society of America - OSA Publishing, 2006, 14 (2), pp.759-766. We demonstrate selective fluorescence We demonstrate selective fluorescence excitation of specific molecular species in live organisms by using coherent control of two-photon excitation. We have acquired quasi-simultaneous images in live fluorescently-labeled Drosophila embryos by rapid switching between appropriate pulse shapes. Linear combinations of these images demonstrate that a high degree of fluorophore selectivity is attainable through phase-shaping. Broadband phase-shaped excitation opens up new possibilities for single-laser, multiplex, in-vivo fluorescence microscopy. © 2006 Optical Society of America (10.1364/OPEX.14.000759)
  DOI : 10.1364/OPEX.14.000759
• An all-optical approach to modulate and quantitatively analyse embryo morphogenetic movements by using ultrashort laser pulses
  
  • Supatto Willy
  • Débarre Delphine
  • Moulia Bruno B.
  • Farge Emmanuel
  • Beaurepaire Emmanuel
  , 2006, 6088. The regulation of morphogenetic movements that shape an embryo during its development remains a challenging issue in developmental biology, and may in certain cases involve mechanical sensitivity. Addressing this issue requires novel experimental approaches. We show that the combination of femtosecond laser pulse-induced ablation and multiphoton microcopy can be used to modulate and quantify morphogenetic movements in Drosophila embryos. We characterized the effects of focused nanoJoule pulse trains in developing embryos. We used targeted ablations to locally modify the embryo structural integrity and modulate morphogenesis. Femtosecond-pulse induced ablation was combined with nonlinear microscopy based on two-photon-excited fluorescence (2PEF) and third-harmonic generation (THG). Correlation-based analysis of microscopy data allowed us to track the outcome of ablations and to analyze tissue deformations. These experiments provided insight into the interplay between gene expression and tissue deformations in developing embryos. (10.1117/12.645897)
  DOI : 10.1117/12.645897
• Structure sensitivity and sources of contrast in third-harmonic generation (THG) microscopy of cells and tissues
  
  • Débarre Delphine
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Supatto W.
  , 2006, 6089. Third-harmonic generation (THG) microscopy can provide structural information from unstained biological samples such as developing embryos. However, the contrast mechanisms in THG imaging need to be better characterized in order to develop practical applications. We studied experimentally and theoretically the influence of sample structure and excitation NA (Rayleigh length) on THG signals for various cases (spheres, interfaces). Because the third-harmonic signal critically depends on the spatial distribution of the Gouy shift, the effect of changing the excitation NA depends on the sample geometry within the focal volume. This phenomenon can be used to highlight certain structures within a complex system. Finally, we measured the nonlinear optical properties of several liquids, and we identified lipid bodies as an important source of contrast in biological THG imaging. We show that the technique can be used to characterize lipid accumulation in a variety of cells and tissues. © (2006) SPIE--The International Society for Optical Engineering (10.1117/12.645819)
  DOI : 10.1117/12.645819
• Spectroscopic analysis of skin intrinsic signals for multiphoton microscopy
  
  • Pena Ana-Maria
  • Strupler Mathias
  • Boulesteix Thierry
  • Senni Karim
  • Godeau Gaston
  • Beaurepaire Emmanuel
  • Schanne-Klein Marie-Claire
  , 2006, 6078. We recorded multiphoton images of human skin biopsies using endogenous sources of nonlinear optical signals. We detected simultaneously two-photon excited fluorescence (2PEF) from intrinsic fluorophores and second harmonic generation (SHG) from collagen. We observed SHG from fibrillar collagens in the dermis, whereas no SHG was detectable from the non fibrillar type IV collagen in the basal laminae. We compared these distinct behaviours of collagens I and IV in SHG microscopy to polarization-resolved surface SHG experiments on thin films of collagens I and IV molecules. We observed similar signals for both types of molecular films, except for the chiroptical contributions which are present only for collagen I and enhance the signal typically by a factor of 2. We concluded that SHG microscopy is a sensitive probe of the micrometer-scale structural organization of collagen in biological tissues. In order to elucidate the origin of the endogenous fluorescence signals, we recorded 2PEF spectra at various positions in the skin biopsies, and compared these data to in vitro spectroscopic analysis. In particular, we studied the keratin fluorescence and determined its 2PEF action cross section. We observed a good agreement between 2PEF spectra recorded in the keratinized upper layers of the epidermis and in a solution of purified keratin. Finally, to illustrate the capabilities of this technique, we recorded 2PEF/SHG images of skin biopsies obtained from patients of various ages. © (2006) COPYRIGHT SPIE--The International Society for Optical Engineering. (10.1117/12.644777)
  DOI : 10.1117/12.644777
• Fluorescence resonance energy transfer using lanthanide-ion doped oxide nanoparticles as donors
  
  • Casanova Didier
  • Giaume D.
  • Amirtha Tina
  • Gacoin Thierry
  • Boilot Jean-Pierre
  • Alexandrou Antigoni
  , 2006, 6096. We have demonstrated fluorescence resonance energy transfer (FRET) between lanthanide-ion doped oxide nanoparticles acting as donors and organic acceptor molecules (Cy5). Due to the long nanoparticle lifetime and the large Stokes shift between nanoparticle absorption and emission, unambiguous and precise FRET measurements can be performed despite the presence of large free acceptor oncentrations. We determined FRET efficiencies as a function of Cy5 concentration which are in very good agreement with a multiple acceptor-multiple donor calculation. © (2006) COPYRIGHT SPIE (10.1117/12.646479)
  DOI : 10.1117/12.646479