MIRThyX
Spectroscopie 2D femtoseconde dans l'infrarouge moyen des flavoenzymes par différence de fréquence intrapulse à 100 kHz
ANR 19-CE30-0001 (10/2019 - 03/2024)
Projet
Grâce à sa sensibilité aux fluctuations ultrarapides et aux couplages entre modes vibrationnels, la spectroscopie infrarouge bidimensionnelle (2DIR) a permis, au cours des vingt dernières années, d’obtenir une grande richesse d’informations sur les réactions chimiques et biochimiques. Parallèlement, les récents progrès en biotechnologie permettent désormais l’insertion d’acides aminés non naturels sur des sites spécifiques de protéines. Certains de ces acides aminés non naturels peuvent servir de sondes vibrationnelles locales, et leur association avec la spectroscopie 2DIR peut offrir une résolution spatiale et temporelle combinée pour l’étude des dynamiques conformationnelles des protéines. Cependant, le développement de cette approche émergente a été freiné par les limitations en termes de rapport signal/bruit et de débit de données des spectromètres 2DIR actuels, le plus souvent basés sur des amplificateurs femtosecondes Titane:Saphir à 1-10 kHz.
L’objectif du projet MIRThyX est de surmonter cette barrière technique en développant un spectromètre 2DIR de nouvelle génération exploitant l’avènement récent des lasers ultracourts à pompage par diode, et d’appliquer cet instrument à l’étude des dynamiques structurales de la flavoenzyme ThyX. Le projet est mené par trois partenaires : deux partenaires académiques, le Laboratoire d’Optique et Biosciences (LOB) et le Laboratoire Charles Fabry (LCF), ainsi qu’un partenaire industriel, Amplitude. La remarquable complémentarité des partenaires couvre ainsi l’ensemble des compétences nécessaires pour réaliser ce projet interdisciplinaire, impliquant technologie laser, génération et caractérisation d’impulsions dans l’infrarouge moyen (MIR), spectroscopie 2DIR et biochimie.
Un atout majeur du projet MIRThyX réside dans une avancée récente, publiée au début de l'année 2019 par deux des partenaires (LCF et AS), qui consiste en la compression temporelle efficace à 7 fs d’impulsions de 300 fs délivrées par un amplificateur à fibre dopée à l’ytterbium. La largeur spectrale des impulsions à haute énergie ainsi obtenues est suffisamment large pour générer directement des impulsions dans l’infrarouge moyen (MIR) par différence de fréquences intrapulse. Cette approche permettra de produire des impulsions MIR dans une configuration simple et monofaisceau à un taux de répétition de 125 kHz, idéal pour la spectroscopie 2DIR à l’équilibre.
Cette source femtoseconde MIR sera ensuite combinée à un interféromètre compact à balayage rapide, associé à un système de détection par CPU (Chirped-Pulse Up-conversion), offrant une excellente résolution dans les dimensions pompe et sonde. Le spectromètre 2DIR résultant, doté d’un rapport signal/bruit, d’une largeur spectrale et d’une résolution spectrale sans précédent, sera démontré dans le cadre de l’étude des dynamiques structurales de la flavoenzyme ThyX. Cette enzyme bactérienne alternative à la thymidylate synthase a pour fonction de produire le nucléotide correspondant à la lettre T de l’ADN. Présente dans de nombreuses bactéries pathogènes mais absente chez l’homme, la flavoenzyme ThyX constitue une cible antimicrobienne prometteuse.
En association avec des simulations de dynamique moléculaire, la spectroscopie multidimensionnelle nous permettra de comprendre comment certains substrats ou inhibiteurs agissent sur les fluctuations structurelles à différents sites d’intérêt, déterminés par la position choisie de notre sonde vibrationnelle. Notre recherche pourrait ainsi contribuer à l’optimisation de nouveaux inhibiteurs.
Au-delà de son impact scientifique sur la spectroscopie 2DIR des protéines, le projet MIRThyX aboutira également à une série de développements instrumentaux concernant la génération, la caractérisation et l’application des impulsions MIR à la spectroscopie 2DIR. La participation du partenaire industriel sera donc essentielle, non seulement pour le développement de la source MIR elle-même, mais aussi pour faciliter une éventuelle valorisation commerciale des instruments innovants conçus au cours du projet.
Résultats
Nous avons développé deux sources MIR accordables : la première fonctionnant à 250 kHz et basée sur la différence de fréquence intrapulse [1-4], et la seconde fonctionnant à 100 kHz et basée sur la génération de fréquences différentielles [3]. Le graphique ci-dessous montre les spectres obtenus avec ces deux sources.
Nous avons étendu la méthode de conversion ascendante d'impulsions chirpées (CPU), précédemment démontrée avec des amplificateurs femtosecondes Ti:Sa à 1 kHz, à ces nouvelles sources MIR à haute fréquence de répétition [5]. Grâce à l'utilisation d'une caméra linéaire CMOS rapide, les spectres convertis en fréquence ont pu être mesurés individuellement à la fréquence de répétition du laser, ici 100 kHz.
La figure ci-dessous montre le spectre correspondant à une impulsion unique (a). Après un traitement approprié par transformée de Fourier, les effets de modulation de phase croisée peuvent être supprimés, produisant un spectre corrigé (b) avec une résolution spectrale de 1 cm⁻¹, comme en témoignent les lignes d'absorption étroites résultant de l'absorption de la vapeur d'eau.
En utilisant la source MIR et la détection par CPU décrites ci-dessus, nous avons développé un spectromètre 2DIR selon le montage schématisé ci-dessous. La séquence de deux impulsions de pompe est générée par un interféromètre de Mach-Zehnder, avec une fréquence de balayage des délais d'environ 2 Hz.
Pour chaque impulsion laser, l'impulsion sonde est mesurée, ainsi que le signal d'interférence provenant d'un faisceau traceur He:Ne, permettant une détermination précise du délai temporel entre les deux impulsions de pompe. L'impulsion sonde mesurée est ensuite accumulée dans le compartiment temporel approprié.
Le graphique ci-dessous présente les spectres 2DIR obtenus dans la carboxyhémoglobine après une transformée de Fourier par rapport au délai temporel entre les deux impulsions de pompe. Les données brutes (a) montrent des oscillations indésirables dues à la diffusion cohérente des impulsions de pompe. Cependant, cet effet peut être atténué en modulant le délai pompe-sonde à l'aide de la cale piézoélectrique (pzt) comme illustré dans la figure précédente.
Le spectre 2DIR ainsi obtenu (b) met en évidence l'élongation attendue le long de la diagonale, qui tend vers une forme plus circulaire (c) à mesure que le temps d'attente augmente [6].
Des travaux sont actuellement en cours pour appliquer ce spectromètre 2DIR à l'étude de l'azido-ThyX.
Publications
[1] Q. Bournet, F. Guichard, M. Natile, Y. Zaouter, M. Joffre, A. Bonvalet, I. Pupeza, C. Hofer, F. Druon, M. Hanna, P. Georges, Enhanced intrapulse difference frequency generation in the mid-infrared by a spectrally dependent polarization state, Opt. Lett. 47, 261 (2022).
[2] Q. Bournet, M. Jonušas, A. Zheng, F. Guichard, M. Natile, Y. Zaouter, M. Joffre, A. Bonvalet, F. Druon, Marc Hanna, P. Georges, Inline amplification of mid-infrared intrapulse difference frequency generation, Opt. Lett. 47, 4885 (2022).
[3] Q. Bournet, M. Natile, M. Jonušas, F. Guichard, Y. Zaouter, M. Joffre, A. Bonvalet, F. Druon, M. Hanna, P. Georges, Intensity noise in difference frequency generation-based tunable femtosecond MIR sources, Opt. Expr. 31, 12693 (2023).
[4] Q. Bournet, M. Jonušas, A. Zheng, F. Guichard, M. Natile, Y. Zaouter, M. Joffre, A. Bonvalet, F. Druon, M. Hanna, P. Georges, Maximizing the efficiency of intrapulse difference frequency generation by pulse shaping and recycling, Appl. Phys. B 130, 33 (2024).
[5] M. Jonušas, Q. Bournet, A. Bonvalet, M. Natile, F. Guichard, Y. Zaouter, P. Georges, F. Druon, M. Hanna, M. Joffre, Chirped pulse upconversion for femtosecond mid-infrared spectroscopy at 100 kHz, Opt. Express 32, 8020 (2024).
[6] M. Jonušas, Q. Bournet, A. Bonvalet, M. Natile, F. Guichard, Y. Zaouter, P. Georges, F. Druon, M. Hanna, M. Joffre, Two-dimensional infrared spectroscopy using chirped pulse up-conversion at 100 kHz, 11th international conference on coherent multidimensional spectroscopy (CMDS), York (2024).